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徒手切割法體細胞克隆研究進展
日期：2025-12-07 13:09
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摘要：
1997年2月，英國<Nature》雜志報道了英國羅斯林研究所的Wilmut等利用綿羊乳腺細胞進行核移植試驗，成功地獲得了世界上**只體細胞克隆綿羊——多利(Dolly)。這一成果有力地證明了成年哺乳動物的體細胞仍具有發育上的全能性，從而開創了哺乳動物細胞核移植的新里程碑，在生物科學史上具有十分重要的意義。到目前為止，體細胞克隆技術已相繼在多種動物上獲得成功，并顯示出巨大的應用潛力和社會效益。
目前影響動物體細胞核移植廣泛應用的主要技術因素有：
(1)核移植效率低；
(2)實驗所需設備費用高。技術難度大；
(3)妊娠率和產仔率低，出生后死亡及異常發育率高。
在克隆過程中成熟卵母細胞去核是核移植技術中的一個重要環節。要求去得干凈，又盡可能地減少對細胞質的損傷。如果去核不完全，可導致重組胚染色體的非整倍性，造成多倍體，卵裂異常，發育受阻和胚胎早期死亡。而如果要保證去核勢必要損失細胞質，否則要使用熒光染色技術。目前使用的主要是顯微操作去核，需要價格昂貴的顯微操作儀和熟練的技術操作人員。此外，還需要相關的輔助工具制作設備如研磨機、微鍛爐等，而對其使用也需一定的技術水平。這些要求相當程度地限制了核移植技術的簡化及廣泛應用。研究不需要顯微操作設備的核移植技術將會對體細胞核移植技術的實際應用起到巨大推動作用。
1 HMC技術
徒手切割法體細胞克隆(Handmade Somatic Cell Cloning，HMC)是一項不需要顯微操作的核移
植方法，*早是Peura等 進行牛胚胎細胞克隆時建立的，Vajta等【3 進一步發展了此方法，成功應用
于牛的體細胞核移植，并且得到后代 。HMC技術路線主要包括卵母細胞的去透明帶，徒手切割半卵
法去核，雙半卵融合、激活，以及支持無透明帶卵／胚胎培養技術。
1．1 卵母細胞去透明帶
1．2 卵母細胞的去核
1．3 卵母細胞的融合
目前常用的是電融合，根據電融合的次數可以分為一步法和兩步法。融合的電壓與動物的種類有關。BLS細胞融合儀是一款專門為哺乳動物設計的細胞融合儀，產品小,易操作,性價比極高.HMC技術結合BLS細胞融合儀CF-150B的使用,已成為此領域研究人員的理想選擇.
1．3．1 一步法
在電融合槽中一次同時將2枚去核后的半卵和1枚供核體細胞粘合在一起進行融合，從而提高電擊融合效率。
具體做法是：
將半卵細胞與供體細胞先放入含有植物凝集素(PHA)的TCM～HEPES液滴中，通過圓頭粘合細玻璃針撥動使一枚半卵先與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚半卵粘在一起，其排列順序為：體細胞一半卵～半卵，然后進行電融合。在融合槽中施加交流電場，可使已經粘成一串的3個細胞自動排序，再給與直流電脈沖，可以一次性同時融合處理14個3細胞串，從而大大提高融合效率。電擊后3Orain內觀察融合情況，沒有融合的再進行電擊一次。
在牛的電融合實驗中，其融合率達到(95．68±3．97) ]。利用一步融合法已經生下5頭體細胞克隆牛
犢。也可以采用先將一枚半卵與一枚供體細胞用PHA法粘合，然后放入融合槽時再加入一枚半卵。
通過手工撥動使粘有體細胞的半卵與另一枚半卵排序，然后通過提供一定電壓的交流電場使3個細胞
緊密聯結在一起，再應用直流電脈沖一次性使3個細胞融合，一次可以融合處理4對細胞。
1．3．2 兩步法
相對一步法而言，主要是進行兩次電融合。
具體過程：
半卯與供體細胞經過有植物凝集素(PHA)的TCMHEPES液滴的處理后，一枚半卵先與供體細胞融合，融合后的半卵再與另一枚半卵進行融合，但是**次融合的電壓要比**次的低。根據Vajta等的報道，經過兩次融合，融合率可以達到76。運用此法進行核移植也得到克隆牛犢-4。j。
1．4 卵母細胞的激活
激活處理主要是化學激活，與常規相同。但也有化學激活與電激活相結合的。采用化學激活時去
透明帶的卵母細胞在二甲氨基嘌呤(DMAP)中采用微穴培養系統(WOW)培養法，一般每孔3O～100
個，具體依據實驗的細胞數目而定。Kragh等 用HMC技術進行豬的體細胞核移植時使用化學激活和
電激活相結合的方法，激活率為(49±1) 。
1．5 重構胚的培養
與傳統核移植重構胚的培養方法不同，HMC的胚胎由于去除了透明帶，其培養系統必須要能夠防
止重構胚的相互粘連，因而采用隔離法群體培養。
1．5．1 微穴培養系統(well of the well，WOW)
WOW *先報道于Vajta等 ，其簡要過程如下：在四孔培養皿中加入培養液并覆蓋石蠟油預熱，然后用胚胎聚集針通過手腕用力并旋轉，在培養皿的底部均勻分布地壓下30～70個(視每組實驗培養的卵母細胞數而定)圓錐形小凹。小凹的底部直徑約為120n，上口直徑約300 f』m，深度約為350 n 。
1．5．2 明膠一孔系統
用胚胎培養液無牛血清白蛋白(BSA)和氨基酸]溶解明膠，濃度為19／6。在四孔板的孔中鋪上一層明膠，然后加入胚胎培養液并在上面覆蓋石蠟油。用直徑為5O～100rn的塑料小管在明膠上作孔，每孔放一個胚胎進行培養。
1．5．3 微管法培養(GO 系統)
GO系統(the glassoviductsystem)就是將重構胚放人一端封Vi的毛細玻璃管中，玻璃管徑的大小要適宜，將培養液加入到玻璃管中然后進行培養。Thouas等在研究小鼠的合子體外發育時，發現GO系統培養的囊胚其內細胞團、滋養外胚層以及早期桑椹胚的細胞數目明顯高于微滴法培養囊胚的細胞數，但操作不如微滴法簡便。
1．6 核移植胚胎的冷凍
2 HMC技術的應用前景
與常規核移植方法相比，HMC技術*大的特點是對實驗設備的要求相對而言不是太高，不需要顯
微操作儀，而且對技術人員的要求也降低許多。常規去核方法主要依靠**極體定位，因此需要必須是有**極體排出的成熟卵母細胞；而HMC技術則不需要那么嚴格，只要成熟的卵母細胞細胞質均勻即可，從而可以提高卵母細胞的利用率。但HMC技術需要兩個卵母細胞才能得到一個重組胚，因而從整體上限制了核移植的成功率，但是核移植的效率卻可以大大提高。此外由于在融合時兩個半卵胞質體來自不同的卵母細胞再加上供體細胞，重構胚的DNA有可能來源于三方面，對胚胎的進一步發育可能會產生影響。
目前通過此方法得到克隆動物還不多，只有牛的成功報道，但是在其他動物如豬 、綿羊現在也展開了研究，并且取得了一定進展。Vanessa等用HMC技術進行牛的體細胞連續核移植(SHMC)，成功得到一頭小牛。同時HMC技術有獨特的優勢如進行胚胎嵌合的研究]。總之，HMC技術由于其獨到的優勢，將會促進核移植技術的發展。隨著該方法進一步的提高和完善，HMC技術在哺乳動物的體細胞克隆胚胎產業化生產中將發揮重要作用。
BLS細胞融合儀與HMC技術相結合,以成為該領域研究人員的理想選擇
